桝田哲哉 農学研究科助教、島村達郎 医学研究科特定講師、潘東青 Max-Planck Institute（元薬学研究科研究員）らは、菅原道泰 理化学研究所放射光科学総合研究センター生物試料基盤グループ研究員、南後恵理子 同SACLA利用技術開拓グループ研究員、岩田想 同ディレクター（京都大学大学院医学研究科教授）、溝端栄一 大阪大学工学研究科助教、鈴木守 同大学蛋白質研究所准教授、登野健介 高輝度光科学研究センター（JASRI）・X線自由電子レーザー（XFEL）研究推進室副主幹研究員らとの共同研究を実施しました。その結果、X線自由電子レーザーを用いて、創薬等に必要な各種のタンパク質の構造を解析するために必要な、新しいサンプルの供給方法の開発に成功しました。
本研究成果は、米国科学雑誌「Nature Methods」に掲載されるに先立ち、オンライン版（11月10日付、日本時間11月11日）に掲載されました。
研究者からのコメント
SACLAの10フェムト秒という超短時間でのX線レーザーの照射を用いたSFXにより、酵素反応などに伴う一連の構造変化が起きるフェムト秒～ピコ秒間の反応過程などの観察が可能になります。また、本研究で開発したグリースによる結晶供給を用いたSFXは、タンパク質結晶のみを研究対象として限定するものではなく、有機、無機物質を問わず、幅広い研究分野への応用が期待できます。
従来の連続フェムト秒結晶構造解析では、最低でもおおよそ1０億個ほどの大量の微結晶が必要でした。また高密度に結晶を調整すると目詰まり等で脈動が発生し、データ取得に長時間を要しました。本研究で用いたグリースマトリックス法は、サンプル量の低減化、高密度化が可能で、短時間に効率よく多くのデータを取得できます。今後この手法を用い、創薬ターゲットタンパク質を含め、放射線損傷のないタンパク質の構造解析が加速されると期待できます。
ポイント
- 高粘度物質のグリースを用いて、結晶供給を制御した世界初の手法
- 従来の1／10～1／100のサンプル量でタンパク質の三次元結晶構造解析が可能
- タンパク質結晶だけでなく有機、無機物質にも応用できる。
概要
原子分解能でタンパク質の三次元結晶構造を決定するには、タンパク質結晶を用いたX線結晶構造解析が適しています。大型放射光施設「SPring-8」の放射光を用いる場合、一般に約30マイクロメートル（μm）以上のタンパク質結晶が必要です。しかし、30μm以上のタンパク質結晶を得るのは困難で、特に創薬などの研究用途で重要なヒトを含む動物由来のタンパク質は、結晶化に使用できる十分な量を得るのが難しく、析出する結晶も回折実験に適した十分なサイズに成長しません。また、実験中にタンパク質結晶が放射線損傷を起こすことも大きな問題でした。
SACLAのX線レーザーを用いた連続フェムト秒（1フェムト秒は1,000兆分の1秒）のX線結晶構造解析が実現すれば、これまで課題だった試料の放射線損傷が起こることなく、ナノメートル～マイクロメートル（nm～μm）サイズのタンパク質の微小結晶でも結晶構造を決定できます。さらに、SFXでは酵素反応に伴う一連の構造変化が起きるフェムト秒～ピコ秒（1ピコ秒は1兆分の1秒）間の反応過程などを観察できます。しかし、タンパク質結晶を連続的にX線レーザーの照射ポイントに供給するには液状の試料を速い流速で噴射するため、結果として大量の試料が必要であること、また、試料の組成によっては実験中に塩結晶が析出するため、タンパク質結晶の安定供給ができないという問題がありました。
そこで本研究グループは、高粘度物質と微小結晶を混ぜ合わせることで、結晶をX線レーザーの照射ポイントに安定して供給できる手法を検討しました。その結果、タンパク質結晶を高粘度物質のグリースに混ぜることで低速で試料を押し出し、少量の試料でさまざまなタンパク質の回折実験が行える手法の開発に成功しました。必要な試料が1mg以下と従来の1／10～1／100程度であり、試料タンパク質が少量でも三次元結晶構造の決定が可能になります。今後、タンパク質に限らず、有機、無機物質といった幅広い研究分野への応用が期待できます。
図：連続フェムト秒結晶構造解析（SFX）とグリースマトリックス法
（a）SFX概念図。X線レーザーの照射ポイントにタンパク質結晶を供給する。（b）タンパク質結晶含有グリースをインジェクターから押し出した際の写真
詳しい研究内容について
書誌情報
[DOI] http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.3172
[KURENAIアクセスURL] http://hdl.handle.net/2433/203008
Michihiro Sugahara, Eiichi Mizohata, Eriko Nango, Mamoru Suzuki, Tomoyuki Tanaka, Tetsuya Masuda, Rie Tanaka, Tatsuro Shimamura, Yoshiki Tanaka, Chiyo Suno, Kentaro Ihara, Dongqing Pan, Keisuke Kakinouchi, Shigeru Sugiyama, Michio Murata, Tsuyoshi Inoue, Kensuke Tono, Changyong Song, Jaehyun Park, Takashi Kameshima, Takaki Hatsui, Yasumasa Joti, Makina Yabashi & So Iwata
"Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography"
Nature Methods Published online 10 November 2014
